诱导小鼠胎肝干细胞向类心肌细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.011

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (32): 5813-5818.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.011

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

诱导小鼠胎肝干细胞向类心肌细胞的分化

吴必刚¹，常静²，张晓刚²

1重庆市铜梁县人民医院，重庆市 402560
2重庆医科大学附属第一医院心内科，重庆市 400016

收稿日期:2012-10-12 修回日期:2012-11-07 出版日期:2013-08-06 发布日期:2013-08-06
通讯作者: 张晓刚，博士，主任医师，重庆医科大学附属第一医院心内科，重庆市 400016
作者简介:吴必刚★，男，1980年生，重庆市铜梁县人，汉族，2009年重庆医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事干细胞的诱导分化研究。 bigangwu@sina.com

Mouse embryonic hepatic stem cells differentiate into cardiomyocyte-like cells

Wu Bi-gang¹, Chang Jing², Zhang Xiao-gang²

1People’s Hospital of Tongliang County, Chongqing 402560, China
2Department of Cardioloy, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Received:2012-10-12 Revised:2012-11-07 Online:2013-08-06 Published:2013-08-06
Contact: Zhang Xiao-gang, M.D., Chief physician, Department of Cardioloy, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
About author:Wu Bi-gang★, Master, Attending physician, People’s Hospital of Tongliang County, Chongqing 402560, China bigangwu@sina.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来胚胎肝干细胞备受关注，该类细胞是否具有向类心肌细胞方向分化的潜能及相关的诱导分化条件，目前报道极少。
目的：探讨体外环境下化学试剂诱导小鼠胎肝干细胞向类心肌细胞方向分化的合适条件。
方法：二甲基亚砜联合5-氮杂胞苷以不同的浓度和时间，作用于13.5 d胎龄的昆明小鼠胎肝干细胞，观察诱导分化效果。
结果与结论：体外环境下，0.8%二甲基亚砜+ 5 μmol/L 5-氮杂胞苷能诱导小鼠胎肝干细胞表达心肌细胞特异性标志物，而增加诱导剂浓度及延长时间不能提高诱导效率。

关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 胎肝干细胞, 二甲基亚砜, 5-氮杂胞苷, 诱导, 分化, 类心肌细胞, α-actin, 肌钙蛋白T, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, embryonic hepatic stem cells have attracted more attention, but there are few reports on the potential of embryonic hepatic stem cells to differentiate into cardiomyocyte-like cells as well as the related differentiation conditions.
OBJECTIVE: To investigate the moderate condition to induce mice embryonic hepatic stem cells to differentiate into cardiomyocyte-like cells in vitro with chemical reagents.
METHODS: Dimethylsulfoxide in combination with 5-azacytidine with different concentrations and time were used to induce the embryonic hepatic stem cells of 13.5 days mice and to observe the differentiation effect.
RESULTS AND CONCLUSION: Under in vitro conditions, 0.8% dimethylsulfoxide+5 μmol/L 5-azacytidine could induce the mouse embryonic hepatic stem cells to express the specific markers of myocardial cells, while increasing the concentration of the inducer and extending the induction time could not improve the induction efficacy.

Key words: stem cells, embryonic stem cells, embryonic hepatic stem cell, dimethylsulfoxide, 5-azacytidine, induction, differentiation, cardiomyocyte-like cells, α-actin, troponin T, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

吴必刚，常静，张晓刚. 诱导小鼠胎肝干细胞向类心肌细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(32): 5813-5818.

Wu Bi-gang, Chang Jing, Zhang Xiao-gang2 . Mouse embryonic hepatic stem cells differentiate into cardiomyocyte-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(32): 5813-5818.

图/表（结果） 3

2.1 诱导胚胎肝干细胞向类心肌细胞方向分化的浓度相关效应

诱导前后细胞形态学变化：诱导前，胚胎肝干细胞多呈现为大小较均一的梭状或者椭圆形，见图1A。细胞排列为无序状或漩涡状，见图1B。

经不同的条件诱导后，各组胚胎肝干细胞出现不同的形态学变化。

A组(二甲基亚砜0.8%+5-氮杂胞苷40 μmol/L)：诱导后1 d，大部分贴壁细胞脱离瓶壁，崩解死亡。残余的细胞在诱导后的两三天内，也相继脱壁死亡，见图1C。

B组(二甲基亚砜0.8%+5-氮杂胞苷20 μmol/L)：诱导后的变化情况与A组基本相同，细胞均在诱导后的短时间内脱壁死亡。

C组(二甲基亚砜0.8% + 5-氮杂胞苷10 μmol/L)：诱导后1 d，小部分细胞脱壁死亡。诱导后三四天，细胞生长趋于停滞。诱导后5-7 d，部分细胞逐渐脱壁死亡，随换液除去。至诱导后2周左右，几乎无贴壁细胞残余。

以上3组，均无法继续进一步的实验。

D组(二甲基亚砜0.8%+5-氮杂胞苷5 μmol/L)：诱导后1 d，出现细胞脱壁死亡的现象很少。诱导后三四天，细胞生长趋于停滞。诱导后1周左右，部分细胞体积变大呈短柱形，见图1D。诱导后2周左右，细胞呈平行排列生长趋势，相邻细胞间似有联结形成，见图1E。诱导后3周左右，平行排列生长的细胞中间，部分短柱形细胞逐渐回缩为小圆形，以此为中心，邻近细胞聚集成团，呈逐步增大趋势，见图1F。至诱导后4周观察结束，出现脱壁死亡现象的细胞数量少，大部分细胞保持良好生存状态。期间未观察到出现自发搏动的细胞。继续下一步实验：检测诱导后的细胞表达心肌细胞特异性标志物的情况。

对照组无以上改变。

诱导后细胞表达心肌细胞特异性标志物：SABC法检测位于细胞浆的心肌细胞特异性标志物troponin T及α-actin：胞浆呈棕黄色为阳性表达。结果为D组(二甲基亚砜0.8%+5-氮杂胞苷5 μmol/L作用24 h)部分细胞呈现阳性表达，对照组细胞未见阳性表达，见图2。

2.2 诱导胚胎肝干细胞向类心肌细胞方向分化的时间相关效应 分为3组：二甲基亚砜0.8%+5-氮杂胞苷 5 μmol/L分别诱导胚胎肝干细胞 24 h组，48 h组，72 h组。各组细胞变化情况不相同：24 h组出现细胞脱壁死亡的现象很少。48 h组和72 h组细胞在诱导后的几天内，逐渐脱壁死亡，见图3。

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引言

材料方法

设计：细胞水平，体外对比观察实验。

时间及地点：实验于2008年10月至2009年5月在重庆医科大学细胞实验室完成。

材料：

实验动物：昆明小鼠系重庆医科大学实验动物中心提供，饲养于清洁级动物房中，自由饮水进食。雌雄小鼠分笼饲养，雌雄以2∶1 比例合笼过夜。次日清晨检查，以雌鼠出现阴栓为受孕，以发现阴栓当日上午计为孕龄0.5 d。选取孕龄为13.5 d的昆明小鼠。

二甲基亚砜联合5-氮杂胞苷诱导小鼠胎肝干细胞向类心肌细胞分化所需的实验试剂和仪器：

诱导胚胎肝干细胞向类心肌细胞方向分化的培养液为L-DMEM液，含有体积分数为15%胎牛血清、1%左旋谷氨酸、1%非必需氨基酸，再加入不同浓度组合的诱导剂。

方法：

胎肝干细胞的获取和培养：0.2%明胶铺被培养瓶/板，于二氧化碳孵箱内放置24 h，吸净明胶，晾干备用。处死孕鼠后取出胚胎，解剖显微镜下分离胎肝，PBS洗涤后剪碎为1 mm³组织块。置离心管内，0.1%的Ⅱ型胶原酶溶液/EDTA 37 ℃水浴振荡消化15 min。上层液体用100目滤器过滤，下层组织重复上述消化过程两三次。等量D-Hank’s溶液终止消化。1 000 r/min离心8 min。弃上清液，沉淀中加L-DMEM培养液(含体积分数为15%胎牛血清)，吹打成悬液。置培养瓶/板中，37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%CO₂孵箱孵育1.5 h，取悬液，再次贴壁1.5 h，取悬液。细胞浓度调整至2×10⁸ L^-¹，种植于培养瓶/板。3 d后换培养液，此后每24 h换液1次。细胞长至80%-90%汇合后，吸去培养瓶/板内培养液，PBS洗涤2次，0.5 g/L的Trypsin/ EDTA消化，镜下观察细胞回缩即添加等量培养液终止。吸管轻轻吹打成单细胞悬液，锥虫蓝染色计数后，细胞浓度调整至2×10⁸ L^-¹，接种于新培养瓶/板中继续培养。

胎肝干细胞的鉴定：采用SABC法进行细胞表面标志物检测。标记方法参照SABC试剂盒说明书进行操作。标记物有人干细胞因子受体(c-kit)、甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、细胞角蛋白19(CK19)。结果参见作者前期的实验报道^[18]。

胚胎肝干细胞的诱导分化：传至第3代的胚胎肝干细胞以1.5×10⁴/cm²密度接种于培养板。当胚胎肝干细胞达80%-90%融合(大约为接种后3 d)，予以含诱导剂的培养液孵育相应时间后，弃去上述培养液。予以PBS重复洗涤3次后，加入含体积分数为15%胎牛血清的DMEM-LG培养液。置入37 ℃、体积分数为20%氧，体积分数为5%二氧化碳，饱和湿度的孵箱中，三四天换液1次。

诱导胚胎肝干细胞向类心肌细胞方向分化的诱导浓度相关效应：在参照文献[19]及作者的前期实验基础上，将二甲基亚砜的浓度固定为0.8%。选择了4种浓度的5-氮杂胞苷与之组合。分别为A组：二甲基亚砜0.8% +5-氮杂胞苷40 μmol/L，B组：二甲基亚砜0.8% +5-氮杂胞苷 20 μmol/L，C组：二甲基亚砜0.8%+5-氮杂胞苷 10 μmol/L，D组：二甲基亚砜0.8%+5-氮杂胞苷 5 μmol/L。诱导剂作用于胚胎肝干细胞24 h。不添加诱导剂的培养液培养的胚胎肝干细胞为对照组。

诱导胚胎肝干细胞向类心肌细胞方向分化的诱导时间相关效应：二甲基亚砜0.8% + 5-氮杂胞苷5 μmol/L分别作用于胚胎肝干细胞 24，48，72 h。不添加诱导剂的培养液培养的胚胎肝干细胞为对照组。

胚胎肝干细胞诱导前后形态学变化：倒置显微镜下观察胚胎肝干细胞诱导前后形态学变化。

心肌细胞特异性标志物表达：诱导4周后，细胞爬片，PBS洗涤后，SABC法检测troponin T及α-actin表达情况。操作方法参照SABC试剂盒说明书，具体如下：①备好干燥细胞爬片，40 g/L的多聚甲醛固定30 min后，PBS漂洗，3×2 min洗去固定液。②体积分数为3%H₂O₂-甲醇溶液处理30 min，PBS中漂洗，3×2 min。③滴加正常山羊血清工作液，室温，湿盒中37 ℃孵育30 min。④吸干封闭血清，滴加1∶100稀释的一抗(troponin T或α-actin)，湿盒中37 ℃孵育2 h。PBS中漂洗，3×2 min。⑤滴加生物素标记二抗工作液，湿盒内37 ℃孵育 30 min。PBS中漂洗，3×2 min。⑥滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记工作液，37 ℃孵育20 min。PBS中漂洗，3×2 min。⑦加入新配制的DAB显色液，常温显色3- 5 min，在光镜下控制反应强度，适时终止反应。⑧自来水充分冲洗。⑨经体积分数为80%、90%、2×100%乙醇脱水，二甲苯透明，每步均为1 min，室温下放置数分钟。⑩中性树胶封固。以未进行诱导处理的胚胎肝干细胞为阴性对照。

主要观察指标：诱导前后胚胎肝干细胞形态，心肌细胞特异性标志物troponin T及α-actin的表达。

讨论

体内、体外诱导实验均已证实间充质干细胞向心肌细胞分化的潜能^[19-30]，研究集中于骨髓间充质干细胞。胚胎肝干细胞是否也具有向类心肌细胞方向分化的潜能；胚胎肝干细胞向类心肌细胞方向分化的诱导条件如何，目前报道极少^[17]。体外环境下联合两种化学试剂诱导胚胎肝干细胞向类心肌细胞方向分化的研究尚无报道。

有研究报道提示：5-氮杂胞苷能诱导小鼠胚胎细胞株10T1/2向成肌细胞分化^[31]；其机制可能为5-氮杂胞苷使细胞去甲基化而激活转录。有研究报道指出：0.5%-1%浓度的二甲基亚砜可诱导中胚层和内胚层来源的组织细胞形成，包括心肌细胞^[19^，^32-33]。机制可能为：在转录水平上调prodynorphin and dynorphin B，继而启动Nkx2.5和GATA4表达，合成MLC-2v和α-MHC；通过细胞内钙离子的释放，启动其向心肌细胞分化的过程。

在早期实验中，作者曾尝试单用5-氮杂胞苷或二甲基亚砜对胚胎肝干细胞进行诱导，诱导成功率并不满意，与相关的文献报道有一定差异^[19^，^34-35]。考虑原因为：①获取干细胞的实验动物种属不同：文献报道的取材动物为成年小鼠、兔、人；本文的取材动物为13.5 d胎龄的昆明小鼠胎鼠。②干细胞的组织类型不同：文献报道的干细胞来源为脂肪组织或骨髓组织，本实验来源于胎肝。③获取干细胞的途径不同：目前胚胎肝干细胞缺乏明确的标志物，导致其分离纯化困难。本实验获取的干细胞，确切而言，是从胎肝中分离的具有良好贴壁能力的干细胞群，可能包含多种干细胞。

其后作者尝试联用5-氮杂胞苷+二甲基亚砜进行实验，得出了前文结果。所用的5-氮杂胞苷的诱导浓度与文献[17]报道有一定差异，除了上文列举的原因外，考虑还可能存在两种诱导剂协同作用的因素。

在实验中始终未发现部分文献报道的细胞经诱导后自发跳动现象，考虑原因为：①影响细胞分化因素极为复杂：包括细胞密度、空间排列、基础营养物、机械动力、细胞因子、生长因子等。正常的心肌微环境，能提供精确条件，促进心肌细胞的发育成熟。而本实验诱导条件是体外环境、化学诱导剂，影响因素单一，远未达到分化为成熟心肌细胞的要求。②不同种属来源、不同组织类型的干细胞转化为成熟心肌细胞的时间和过程不同。所以，严格来说，这次实验中经化学试剂诱导后表达心肌细胞特异标志物的细胞，称为类心肌细胞或心肌前体细胞，更为合适。

实验中干细胞诱导后出现损伤的原因，目前不明确。推测以下可能：①化学试剂的毒性作用：5-氮杂胞苷具有明确的细胞毒性作用；二甲基亚砜虽然毒性低，但两者合用，毒性是否会叠加，尚不明确。②缺乏其他条件的支持：细胞分化需多因素协同拮抗作用。本实验是在体外环境下，对分离的细胞进行诱导，远未达到体内细胞所处的微环境条件。

总之，实验直观证实了胚胎肝干细胞向类心肌细胞方向分化的潜能；对胚胎肝干细胞向类心肌细胞方向分化的诱导条件，作了进一步探索；筛选出体外环境下二甲基亚砜0.8%+5-氮杂胞苷5 μmol/L联合诱导胚胎肝干细胞，能向类心肌细胞方向分化这一条件；并得出了该诱导剂浓度条件下，24 h为合理的诱导时间的结论，为胚胎肝干细胞的进一步研究做出了相应的探索。

诱导小鼠胎肝干细胞向类心肌细胞的分化

Mouse embryonic hepatic stem cells differentiate into cardiomyocyte-like cells

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